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6. Protocolo de ensayo
Imegen-Pancreatitis NGS incluye una placa de PCR con los oligonucleótidos necesarios para
amplificar las regiones genómicas de interés mediante reacciones de PCR convencional. En
cada uno de los pocillos se han añadido los cebadores necesarios para la amplificación de
varios exones y regiones intrónicas adyacentes mediante una PCR multiplex.
1
A
P1
B
P2
C
P3
D
P4
E
P5
F
P6
G
P7
H
P8
Figura 1. Distribución de los oligonucleótidos multiplexados para la amplificación de las regiones de
interés. P1-P19, número de las reacciones de PCR; CPCR, control negativo de PCR.
Nota: Para optimizar el proceso y los reactivos del kit, se recomienda procesar 4 muestras de
forma simultánea.
6.1 Preparación de las reacciones de amplificación
1. Descongelar los siguientes reactivos y muestras: Pancreatitis Master Mix, Pancreatitis PCR
plate, el agua y el ADN de las muestras. Agitar en vortex cada uno de los reactivos y
mantener en frío.
2. Por muestra se utilizará un tubo de Pancreatitis Master Mix. Añadir 110 µL de agua en el
tubo Pancreatitis Master Mix, agitar en vortex y centrifugar este mix de PCR.
3. Imegen recomienda incluir un control negativo (CPCR) en cada ensayo de secuenciación
para verificar la ausencia de contaminación. Para ello, dispensar en una placa de 96
pocillos, 17.5 µL del mix de PCR al pocillo del control de PCR (CPCR) y añadirle 5 µL de
agua.
4. El resto de reacciones de PCR contendrán ADN. Añadir al mix de PCR 105 µL de ADN de la
muestra a 10 ng/µL.
Opcional: Si se van a utilizar los reactivos de trazabilidad, se recomienda preparar un
volumen de 150 µL de ADN diluido a 10 ng/µL y añadir 10 µL de uno de los doce o
veinticuatro reactivos de seguimiento de la muestra (Sample tracking A Kit, REF. IMG-234;
Rev. 4. 07/02/2019
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3
4
5
P9
P17
P10
P18
P11
P19
P12
CPCR
P13
P14
P15
P16
6
7
8
9
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