®
TECHNOZYM
vWF:CBA ELISA
DESCRIPTION DU PRODUIT
UTILISATION PRÉVUE
Le Facteur de von Willbrand (vWF) est une grande protéine multifonctionnelle, qui occupe une position
clé au cours de l'hémostase primaire. Elle a une structure multimérique et remplit plusieurs fonctions:
C'est la protéine de transport du Facteur VIII dans le plasma; un complexe se forme,
protégeant ainsi le Facteur VIII d'une dégradation protéolytique précoce.
Il agit en tant que médiateur de l'agrégation plaquettaire en s'attachant aux récepteurs de la
membrane plaquettaire (GP Ib et GP IIb\IIIa) après une première activation des plaquettes.
Il joue un rôle dans l'hémostase primaire en agissant en tant que médiateur lors de l'adhésion des
plaquettes au sous endothélium lors de lésion(s) vasculaire(s).
Le syndrome de Willbrand est une maladies hémorragique qui se transmet très fréquemment, elle peut
être héréditaire ou acquise, et est à l'origine de l'absence ou de défaut de fonctionnement du vWF.
Afin d'analyser les propriétés adhésives, l'agrégation plaquettaire est mesurée en routine. Cependant,
cela ne reflète ni les propriétés physiologiques du vWF ni ses propriétés fonctionnelles. La capacité de
liaison du vWF au collagène sert de paramètre pour déterminer les propriétés adhésives du vWF car
elle reflète ses propriétés physiologiques
CONTENU
1. 12 bandelettes de test ELISA contenant 8 puits chacune avec du collagène humain
de type III,et un agent détissant ; emballés dans un sac d'aluminium.
2. Tampon de lavage concentré: (PBS; pH 7,3) ; contenant du détergent; 0,01% de
merthiolate; 1 bouteille 80 mL.
3. Tampon d'incubation: (PBS ; pH 7,3) ; 1 bouteille 90 mL prêt à l'emploi, Proclin 300, et colorant.
4. Calibrateur numérotés; lyophilisés; chacun dans une fiole.
Les concentrations sont dépendant du lot; consulter les étiquettes sur les fioles.
5. 2 Contrôles plasmatiques "high level" et "low level" ; lyophilisés; une bouteille de chaque. Les
concentrations sont dépendant du lot; consulter les étiquettes sur les fioles.
6. Conjugué concentré (anticorps polyclonal dirigé contre le vWF marqué à la peroxydase de
Raifort) de couleur bleu, une fiole, 0,3 mL.
7. Chromogène TMB (tétraméthylbenzidine); 1 bouteille, 12 mL ; prêt à l'emploi.
8. Solution d'arrêt: acide sulfurique 1,9 mol\L; 1 bouteille 12 mL; prêt à l'emploi.
9. 2 films adhésives for les bandes de tests ELISA.
MATÉRIEL REQUIS
(non fourni avec le kit)
1. Eau distillée
2. Tubes de dilution pour les calibrateurs et les échantillons
3. Eprouvette graduée de 1000 mL
4. Pipettes de précision (10, 100, 1000 µL)
5. Pipette variable (1000 µL)
6. Pipettes multi canal (100, 200 µL)
7. Automate de lavage ELISA ou pipette multi canal.
8. Lecteur de plaque ELISA équipée d'un filtre à 450 nm et si possible d'un filtre de
référence à 620 nm.
STABILITÉ ET STOCKAGE
Tous les composants de ce kit doivent être utilisés avant la date de péremption indiquée. La stabilité
des composants après ouverture, reconstitution et\ou dilution est documentée dans le tableau ci-
dessous:
Si nécessaire, les échantillons, contrôles et standards peuvent être congelés et décongelés jusqu' â 5
fois, cependant effectuer des alicquots est le plus recommandé.
Matériel/Réactif
État
calibrateut et contrôles après reconstitution
ELISA test strip
Après ouverture
tampon
de
lavage
Après ouverture
concentré
1+11,5
dilution
tampon de lavage
concentré
tampon d´incubation
Après ouverture
Après ouverture
Conjugé
Solution conjugué prête
à l'emploi
substrat TMB
Après ouverture
PROCÉDURE DU TEST
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Matériel : Plasma
Obtention des plasmas : Mélanger 9 volume de sang veineux avec 1 volume de solution Sodium
Citrate (0,11mol\L) et centrifuger pendant 15 minutes à une vitesse minimum de 2500 g (DIN 58905).
Les échantillons de plasmas doivent être stockés pendant 3 heures à température ambiante, ou
doivent être immédiatement congelés après centrifugation. Les plasmas ainsi obtenus sont stables à -
20°C pendant 6 mois.
PRÉPARATION DES RÉACTIFS
1. Tous les composants doivent être amenés à la température ambiante avant de commencer le test.
2. Préparation du tampon de lavage: Diluer 1 vol de tampon de lavage concentré avec 11,5 vol d'eau
distillée (1+11,5). Bien mélanger! Il se peut qu'il y ait des précipitation cristallines: celles-ci se
dissolvent à 37^C en 10 minutes à température ambiante.
3. Reconstitution des calibrateurs et des contrôles plasmatiques: Les calibrateurs et les contrôles
plasmatiques sont reconstitués avec 500 µL d'eau distillée et mélangés pendant 10 secondes après 15
minutes de temps de reconstitution. Les composants ainsi reconstitués sont claires ou très légèrement
troubles.
4. Dilution des calibrateurs, contrôles plasmatiques et des échantillons (1+25): Diluer 20 µL
d'échantillon, 20 µL de calibrateurs, et\ou 20 µL de contrôle plasmatique avec 500 µL de tampon
d'incubation chacun. Mélanger pendant 10 sec.
5. Préparer la solution conjugué prête à l'emploi (1+50): Diluer 1 vol de solution de conjugué concentré
avec 50 vol de tampon d'incubation.
Pour 8 puits de test: Mélanger 20 µL de conjugué concentré avec 1000 µL de tampon d'incubation.
PERFORMANCE DU TEST
Calibrateurs dilués, Contrôles plasmatiques dilués,
INCUBATION
DE
Echantillons dilués dans chaque puit.Couvrir les
L'ÉCHANTILLON
bandelettes avec un film.
(références 1, 2)
Incuber à température ambiante
LAVAGE (référence 1,3,4)
TAMPON DE LAVAGE
Pipeter la solution de conjugué prête à l'emploi dans
RÈACTION DU CONJUGAT
les puits, couvrir les bandelettes de test avec un film.
(référence 1,2)
Incuber à température ambiante
LAVAGE (référence 1,3,4)
TAMPON DE LAVAGE
pipeter la solution de substrat dans chaque puit.
RÈACTION DU SUBSTRAT
Couvrir les bandelettes avec un film.
(référence 1,2)
Incuber à température ambiante
SOLUTION
D´ARRET
pipeter la solution d'arrêt dans les puits
(reference 1,2)
MEASURE (référence 5, 6)
Lecteur de plaque ELISA, 450 nm
Température ambiante: 20...25°C
Stockage
Stabilité
Température ambiante
8 heures
-20°C
6 mois
2 ... 8 °C sous film adhésif
Date de péremption
avec agent détissant dans
un sac en plastique
2 ...8°C
6 mois
du
2 ... 8 °C
3 semaines
2 ... 8 °C
2 mois
2 ... 8 °C
6 mois
Température ambiante
60 minutes
2 ... 8 °C
Date de péremption
100 µL
45 minutes
3 x 200 µL
100 µL
45 minutes
3 x 200 µL
100 µL
15 minutes
100 µL
Références:
1. Ne pas utiliser ensemble des réactifs provenant de différents lots.
2. Le bon déroulement et la précision du test dépendent des facteurs suivants:
Bien mélanger les substances utilisées lors des dilutions
Les standards, les contrôles et les échantillons doivent testés en dupliqué.
Les incubations doivent effectuées à la bonne température.
Respecter strictement l'ordre de pipetage et le temps pour chaque élément comme indiqué:
le temps d'incubation des échantillons, conjugués, et substrat démarre après le pipetage du
dernier échantillon. Les temps d'incubation ne doivent pas varier de +/- 10%.
Durant l'incubation de l'échantillon et la réaction du conjugué, le temps nécessaire au
pipetage du calibrateur/échantillon/contrôle plasmatique dilué et/ou des solutions de
conjugué, ne doivent pas excéder 60 secondes par bandelette de test ELISA (8 puits).
Durant la réaction du substrat et lors de l'arrêt de la réaction, le temps nécessaire au
pipetage du substrat ne dois pas excéder 10 secondes par bandelette. Pour cela utiliser
de préférence une pipette multi canal.
3. Numéroter les bandelettes avec un feutre résistant à l'eau au cas où les bandes tombent
accidentellement de la plaque durant le test.
4. Après le dernier lavage, les puits doivent être rigoureusement secs : Pour cela positionner la
plaque d'analyse sur du papier absorbent et taper doucement la plaque d'analyse
5. Mesurer l'absorbance à 450 et 620 nm ou à 450 et 690 nm, la précision du test est alors
Augmentée
6. Secouer 10 sec.,Mesurer dans un intervalle de10 minutes
LIMITES DU TEST
Les faibles niveaux de vWF:CBA sont associés au groupe sanguin O.
Les niveaux d'antigènes vWF:CBA dépendent de l'exercice physique, la grossesse, l'utilisation
de pilules contraceptives, du groupe ethnique, le niveau de l'antigène augmente aussi avec
l'age.
AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS
-
Tous les produits élaborés à partir de sang humain et de plasma doivent être considérés comme
étant potentiellement infectieux. Ils doivent être manipulés avec une attention particulière, et ceci
dans la stricte observance des règles de sécurité. Les règles concernant le stockage des déchets
sont identiques à celles appliqués à l'hôpital.
-
Les standards et contrôles plasmatiques sont élaborés à partir de sang humain, et tout plasma
utilisé lors du test est HBS Ag, HIV ½ et HCV-Ag-négatif (voir les étiquettes sur le kit et/ou sur les
bouteilles).
-
a solution d'arrêt (acide sulphurique) peut être irritante pour la peau. En cas de contact avec les
yeux, rincer immédiatement avec de l'eau distillée et consulter un docteur.
-
Les réactifs contiennent des agents préservant (merthiolate). Ne pas avaler! Eviter tout contact
avec la peau ou les muqueuses.
RÉSULTATS DU TEST
CALCUL DES RÉSULTATS
Établissement de la courbe de référence:
Axe X : Concentration de vWF:CBA U/ml (1 U/mL=100%)
Axe Y : Absorbance
La courbe de référence est linéaire linéaire en point au point ou cubic spline.
Evaluation de la courbe de référence:
Le coefficient de la courbe d'extinction du calibrateur le plus grand devrait se situer entre 1,0
et 2,5.
La validité du test doit être vérifiée sur la base des valeurs calculées des contrôles
Exemple de courbe de référence :
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,2
0,4
0,6
vWF:CBA U/ml
Mesure des concentrations des échantillons:
Lire la concentration à partir de la courbe de référence.
Si des échantillons présentent un coefficient d'extinction supérieur à celui du plus haut point
de la courbe de référence, il doit alors être pré dilué avec le tampon d'incubation (1+1), et la
concentration mesurée doit alors être multipliée par 2.
GAMME DE RÉFÉRENCE
La gamme normale de référence est comprise entre 0,4 et 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
Il est recommandé que les différents laboratoires établissent leur propre gamme.
STANDARDISATION
Le matériel utilisé pour la standardisation est le calibrateur international pour le facteur VIII de
la coagulation sanguine et le facteur plasmatique de von Willebrand homologué par l'OMS.
PERFORMANCES
Les performances sont établies à partir des données ci-dessous. Les résultats obtenus peuvent varier
selon les Laboratoires.
PRECISION
La reproductibilité a été déterminée avec différents échantillons (en séries et sur plusieurs jours) Les
résultats suivants on été obtenus:
Intra assay
échantillon 1
N
24
Mean (U/mL)
1,372
SD (U/mL)
0,020
CV (%)
1,47%
COMPARAISON DES METHODES OU CORRELATION
Le coffret TECHNOZYM vWF:CBA (Technoclone) a été corrélé à deux méthodes comprenant 113
échantillons (24 échantillons de patients normaux et 89 échantillons de patients ayant une maladie de
Willebrand de type 1 (n=26), de type 2A/2B (n=11), de type 2M (n=45), de type 2N (n=4) et de type 3
(n=3). Une corrélation a été faite avec le coffret Asserachrom vWF:CB de Stago avec pour résultat une
pente = 0.90 et r = 0.98. Une corrélation a été faite avec le coffret Collagen Binding Assay de Life
Diagnostics (utilisant du collagène de cheval 95% type I, 5% type III) avec pour résultat une pente =
0.95 et r = 0.99.
ZONE DE MESURE:
0.01 – 1.70 U/mL
La zone de mesure effective pour chaque série de tests dépendra évidemment de la valeur du
calibrateur 1.
LIMITE DE DETECTION:
0.01 U/mL
LITTÉRATURE
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection
of VWD and discrimination of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding
assay. Siekmann et al.
7 / 8
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Inter assay
échantillon 2
échantillon 1
24
10
1,630
1,366
0,029
0,074
1,75%
5,39%
FR
échantillon 2
10
0,306
0,013
4,13%