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8. Añada agua desionizada para reemplazar cualquier volumen que
se haya perdido por evaporación durante el proceso de
calentamiento.
Continúe con Sección C, Paso 1, "Moldeo del gel" en la página 12.
B. Preparación del gel de agarosa y el tampón de electroforesis - ARN
Las moléculas de ARN se separan mediante electroforesis mediante geles
desnaturalizantes antes del análisis mediante hibridación northern. Para la
electroforesis de ARN se utilizan habitualmente geles de agarosas que contienen
(1, 2, 3)
formaldehído
. A continuación se presenta un protocolo general para la
electroforesis de ARN utilizando geles de formaldehído.
¡PRECAUCIÓN! Todos los equipos y soluciones utilizadas en el siguiente
NOTA:
El siguiente protocolo dará 50 ml de un gel de agarosa al 1,5 % que contenga un
tampón 1X MOPS [ácido 3-(N-morfolino)-propanosulfónico]-Acetato-EDTA (MAE)
y 2,2 M de formaldehído, lo que da como resultado un gel con un espesor de 7,5
mm:
1. Pese 0,5 g de agarosa y colóquelos en un matraz de 125 ml.
2. Añada 43,5 ml de agua tratada con DEPC (o anhídrido acético).
3. Tome nota del volumen total de la solución para que se pueda
determinar y corregir el grado de evaporación.
4. Caliente la suspensión de agarosa en un microondas durante 60
segundos. Agite el matraz para asegurarse de que penetran en la
solución los granos adosados a las paredes. La agarosa sin
disolver se muestra como pequeñas "lentes" que flotan en la
solución. Caliente durante entre otros 30 y 60 segundos. Vuelva a
examinar la solución y repita el proceso de calentamiento hasta
que la agarosa se disuelva completamente.
protocolo deben tratarse con DEPC (pirocarbonato de
dietilo) o anhídrido acético antes de usar para inhibir la
actividad de RNasa (véase el protocolo en la Sección II,
página 4). Se recomienda que se realicen soluciones
especializadas exclusivamente para el trabajo de ARN
para reducir al mínimo el riesgo de degradación de la
muestra debido a actividad de RNasa.
Se ha informado de que la tinción de muestras de ARN
con bromuro de etidio reduce la eficiencia de
transferencia de las muestras. Por lo tanto, si las
muestras se van a analizar mediante hibridación northern
después de la electroforesis, realice carriles duplicados
para la tinción, o reduzca la exposición de las muestras
de ARN al bromuro de etidio siguiendo el protocolo de
tinción después de la electroforesis de la página 12.
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