DRG EIA-2395 Instrucciones De Uso página 17

6.2 Testdurchführung
Jeder Lauf muss eine Standardkurve beinhalten.
1. Die benötigte Anzahl Wells in der Halterung befestigen.
2. Je 15 µL Standard, Control und Proben mit neuen Plastikspitzen in die entsprechenden Wells geben.
3. 100 µL Assay Buffer in jedes Well geben.
Für 10 Sekunden gut schütteln. Es ist sehr wichtig, in diesem Schritt eine komplette Durchmischung zu erreichen.
4. 120 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Den Inhalt der Wells kräftig ausschütteln. Wells 3-mal mit 300 µL verdünnter Wash Solution waschen. Verbleibende
Flüssigkeit durch Ausklopfen der Wells auf saugfähigem Papier entfernen.
Achtung: Die Sensitivität und Präzision dieses Assays wird erheblich beeinflusst von der korrekten Durchführung
des Waschschrittes!
6. 100 µL Antiserum in jedes Well geben.
7. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
8. Den Inhalt der Wells kräftig ausschütteln. Wells 3-mal mit 300 µL verdünnter Wash Solution waschen. Verbleibende
Flüssigkeit durch Ausklopfen der Wells auf saugfähigem Papier entfernen.
9. 100 µL Enzyme Complex in jedes Well geben.
10. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
11. Den Inhalt der Wells kräftig ausschütteln. Wells 3-mal mit 300 µL verdünnter Wash Solution waschen. Verbleibende
Flüssigkeit durch Ausklopfen der Wells auf saugfähigem Papier entfernen.
12. 100 µL Substrate Solution in jedes Well geben.
13. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
14. Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 50 µL Stop Solution in jedes Well abstoppen.
15. Die Optische Dichte bei 450 ± 10 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät innerhalb von 10 Minuten nach Zugabe
der Stop Solution bestimmen.
6.3 Ergebnisermittlung
1. Die durchschnittlichen Werte der Optischen Dichte (OD) für jedes Set von Standards, Controls und Patientenproben
bestimmen.
2. Eine Standardkurve ermitteln durch Auftragen der mittleren Optischen Dichte jedes Standards gegen die
Konzentration, wobei der OD-Wert auf der vertikalen (Y) Achse und die Konzentration auf der horizontalen (X) Achse
eingetragen wird.
3. Unter Verwendung der mittleren OD wird für jede Probe die entsprechende Konzentration aus der Standardkurve
ermittelt.
4. Automatische Methode: Die in der Gebrauchsanweisung angegebenen Werte wurden automatisch mit Hilfe der
4 Parameter-Gleichung bestimmt. (4 Parameter Rodbard oder 4 Parameter Marquardt sind die bevorzugten
Methoden.) Andere Auswertungsfunktionen können leicht abweichende Werte ergeben.
5. Die Konzentration der Proben kann direkt von der Standardkurve abgelesen werden. Proben, die eine höhere
Konzentration als die des höchsten Standards enthalten, müssen verdünnt werden. Dieser Verdünnungsfaktor muss
bei der Berechnung der Konzentration beachtet werden.
6.3.1 Beispiel für eine Standardkurve
Nachfolgend wird ein typisches Beispiel für eine Standardkurve mit dem DRG ELISA gezeigt. Diese Werte sollten nicht
zur Berechnung von Patientendaten verwendet werden.
Version 10.0 2017/05 - vk
Leptin Sandwich ELISA EIA-2395
Standard
Standard 0 (0 ng/mL)
Standard 1 (2 ng/mL)
Standard 2 (5 ng/mL)
Standard 3 (25 ng/mL)
Standard 4 (50 ng /ml)
Standard 5 (100 ng/mL)
-
16 -
Optische Dichte (450 nm)
0,02
0,07
0,16
0,74
1,41
2,30