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Resumen de contenidos para Imegen SCAs
- Página 1 Instrucciones de uso ® Imegen SCAs IMG-152 Fabricado por: Instituto de Medicina Genómica SL Agustín Escardino 9, Parc Científic de la Universitat de València 46980 Paterna (Valencia, España) +34 963 212 340 - info@imegen.es imegen.es Rev. 5 28/02/2020...
- Página 2 Imegen le garantiza que todos sus productos están libres de defectos, tanto en los materiales empleados como en su proceso de fabricación. Esta garantía se hace extensible hasta la fecha de caducidad, siempre que se observen las condiciones de conservación especificadas en este manual.
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Página 3: Tabla De Contenido
Índice 1. Información general 2. Uso previsto 3. Características técnicas 4. Advertencias y precauciones de seguridad 5. Contenido y condiciones de almacenamiento del kit 6. Equipos, reactivos y materiales necesarios que no se suministran 7. Protocolo de ensayo 7.1 Preparación de las reacciones de amplificación 7.2 Preparación de la placa de fragmentos 7.3 Electroforesis capilar 8. -
Página 4: Información General
CAG. Excepto en el caso de SCA17 que se caracteriza con la expansión de los trinucleótidos CAG y CAA. Por tanto, el diagnóstico de SCAs se lleva a cabo por la identificación del número de repeticiones del trinucleótido que genera la expansión. - Página 5 Adicionalmente, el kit imegen-SCAs incluye el análisis de la atrofia dentatorubral-pallidoluysian (DRPLA) porque es un trastorno neurodegenerativo que muestra similitudes con las SCA, como el tipo de herencia (autosómica dominante), el tipo de mutación (expansión de un trinucleótido CAG) y algunos síntomas (principalmente ataxia cerebelar).
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Página 6: Uso Previsto
2. Uso previsto Mediante el uso del kit imegen-SCAs se pueden analizar las expansiones de tripletes CAG o CAG/CAA asociados a ataxias cerebelosas y a la atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (DRPLA) mediante PCR convencional y electroforesis capilar. Además, el kit ofrece un sistema de TP-PCR (triplet repeat primed PCR) para detectar las expansiones mayores de SCA2 y SCA7, no detectables con la PCR convencional. -
Página 7: Características Técnicas
Este kit ha sido validado utilizando muestras objeto de análisis del interlaboratorio de EMQN (European Molecular Genetics Quality Network), así como muestras analizadas previamente por el servicio de genética médica de imegen y permite detectar específicamente las expansiones objeto de análisis de este kit. -
Página 8: Advertencias Y Precauciones De Seguridad
12. El fabricante no garantiza la reproducibilidad del ensayo cuando el usuario introduce reactivos no validados por imegen, por considerarlos equivalentes a los suministrados en el kit. Rev. 5 28/02/2020 Página 8 de 22... -
Página 9: Contenido Y Condiciones De Almacenamiento Del Kit
Ataxia A Master Mix: Master Mix de PCR con las cantidades de nucleótidos, betaína, MgCl tampón necesarios para llevar a cabo las reacciones: Pocillos A, B, C, D, E y F de la tira SCAs Master Mix. - Página 10 8 x 60 µl -20ºC TP SCA2 Master Mix Disco Verde 60 µl -20ºC TP SCA7 Master Mix Disco Morado 60 µl -20ºC Positive Control Tapa Azul -20ºC Tabla 3. Contenido del kit imegen-SCAs Rev. 5 28/02/2020 Página 10 de 22...
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Página 11: Kits Complementarios
(Ref: IMG-173), imegen-SBMA (Ref: IMG-153), imegen- Huntington (Ref: IMG-154), imegen-Friedreich (Ref: IMG-155). Todos ellos junto con el kit imegen- SCAs, han sido diseñados usando el mismo programa de PCR, por lo que se pueden analizar conjuntamente. -
Página 12: Protocolo De Ensayo
Protocolo de ensayo 7.1 Preparación de las reacciones de amplificación El kit imegen-SCAs ha sido diseñado para llevar a cabo 10 reacciones por cada muestra que se desea analizar (8 de PCR y 2 de TP-PCR) para un total de 12 determinaciones. - Página 13 En una placa de 96 pocillos dispensar 15 µL del Mix A a los pocillos correspondientes a las filas A, B, C, D, E y F de la placa. Habrá que rellenar tantas columnas como número de muestras o controles se vayan a analizar simultáneamente. De la misma manera, dispensar 15 µL del Mix B a los pocillos correspondientes a las filas G y H de la placa para las reacciones de PCR de SCA2 y SCA7.
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Página 14: Preparación De La Placa De Fragmentos
7.2 Preparación de la placa de fragmentos Para llevar a cabo la electroforesis capilar, hay que preparar los productos de PCR y TP-PCR (fragmentos) en una placa de 96 pocillos compatible con el equipo de electroforesis capilar, tal y como se indica a continuación: 1. - Página 15 Figura 1. Parámetros optimizados para el secuenciador 3730xl DNA La intensidad de la detección puede variar entre los distintos equipos, dependiendo del modelo, del estado del sistema óptico del equipo y del tiempo y voltaje de inyección. Por ello, puede ser necesario, aumentar o disminuir la cantidad de marcador de tamaño o de producto de PCR requeridos para llevar a cabo la electroforesis capilar.
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Página 16: Análisis De Los Resultados
, como en nuestros laboratorios durante la validación del kit. Debido a las variaciones descritas de una repetición entre distintos laboratorios, desde Imegen recomendamos el uso de una muestra con una repetición de tamaño conocido, usando la siguiente fórmula (Ejemplo: 8 repeticiones). ñ... - Página 17 A continuación se muestran unas imágenes como ejemplo de los posibles resultados. 29 repeticiones 43 repeticiones Figura 2. Muestra con un alelo normal y un alelo expandido para el sistema SCA1 SCA 1 SCA 2 SCA 3 SCA 6 SCA 7 SCA 12 SCA 17 DRPLA...
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Página 18: Resultados De Tp-Pcr
Sistema nº pares de bases nº repeticiones SCA1 SCA2 SCA3 SCA6 SCA7 SCA12 SCA17 DRPLA Tabla 6. Repeticiones y tamaño de los alelos del control positivo en cada sistema Debido a la presencia de restos de cebadores marcados no consumidos durante la PCR y TP-PCR y a dímeros de primers, se pueden detectar picos inespecíficos, pero siempre fuera del rango de análisis, por lo que no interfieren con la buena interpretación de los resultados. - Página 19 Alelo expandido Alelo no expandido procedente del control positivo Figura 4. Alelos expandidos y no expandidos para el sistema de TP-PCR de SCA2 Alelo expandido Alelo no expandido procedente del control positivo Figura 5. Alelos expandidos y no expandidos para el sistema de TP-PCR de SCA7 Rev.
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Página 20: Troubleshooting
√ expansiones Tabla 7. Interpretación de los posibles resultados con el kit imegen-SCAs Cantidad y/o calidad de ADN molde insuficiente: Comprobar que el ADN ha sido correctamente cuantificado y usar la cantidad indicada de ADN molde. En caso de que el ADN haya sido correctamente cuantificado, comprobar su integridad y llevar a cabo una nueva extracción si es necesario. - Página 21 3 pares de bases del pico predominante. Mosaicismo: En algunos SCAs, como el SCA2 y el SCA6, han sido descritos casos de mosaicismo, por lo tanto es posible, aunque poco probable, encontrar más de un genotipo en una muestra. En este caso aconsejamos repetir la PCR, y en caso de obtener el mismo patrón, utilizar una nueva...
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Página 22: Limitaciones
10.2 Reactivos Imegen-SCAs se ha validado empleando los reactivos incluidos en el kit y los recomendados en el apartado 6 de este manual (Equipos y materiales necesarios que no se suministran). Para la electroforesis capilar se recomienda emplear los reactivos recomendados por el proveedor del secuenciador: ThermoFisher Scientific.