Protocolo De Ensayo; Preparación De Las Reacciones De Amplificación - Imegen SCAs Instrucciones De Uso

7.

Protocolo de ensayo

7.1 Preparación de las reacciones de amplificación
El kit imegen-SCAs ha sido diseñado para llevar a cabo 10 reacciones por cada muestra que se
desea analizar (8 de PCR y 2 de TP-PCR) para un total de 12 determinaciones.
En cada ensayo se recomienda añadir un control negativo de PCR para comprobar que los
reactivos empleados no están contaminados con ADN y un control positivo que permita
comprobar el funcionamiento de todos los sistemas de amplificación y normalizar el resultado
obtenido en base al tamaño del fragmento obtenido para cada tipo de análisis.
Para estimar la cantidad de reactivos necesaria, se debe tener en cuenta el número de muestras
y controles a analizar simultáneamente. Recomendamos realizar los cálculos, considerando una
reacción más, o bien, incrementando un 10% el volumen de cada reactivo.
Se prepararán 2 mixes distintos, uno para las reacciones de PCR de SCA1, SCA3, SCA6, SCA12,
SCA17 y DRPLA (Mix A), y otro para las reacciones de PCR de SCA2, SCA7 y TP-PCR de SCA2 y
SCA7 (Mix B). A continuación se muestra el protocolo recomendado para la preparación de las
reacciones de amplificación:
1. Descongelar todos los reactivos y el ADN de las muestras. Agitar en vortex cada uno de los
reactivos y mantener en frío.
2. En un tubo de 1.5 mL, preparar el Mix A de PCR añadiendo los siguientes reactivos. Agitar
en vortex y dar un spin.
Reactivos
Ataxia A Master Mix
General Master Mix III
3. En un tubo de 1.5 mL, preparar el Mix B de PCR y TP-PCR añadiendo los siguientes
reactivos. Agitar en vortex y dar un spin.
Reactivos
Ataxia B Master Mix
General Master Mix IV
Rev. 5 28/02/2020
Cantidad por muestra
60 µL
30 µL
Cantidad por muestra
59.2 µL
0.8 µL
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