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7.2 Preparación de la placa de fragmentos
Para llevar a cabo la electroforesis capilar, hay que preparar los productos de PCR y TP-PCR
(fragmentos) en una placa de 96 pocillos compatible con el equipo de electroforesis capilar, tal y
como se indica a continuación:
1. Añadir a un tubo de 1.5 mL los siguientes reactivos:
Recomendamos realizar los cálculos considerando una reacción más, o bien, incrementando
en un 10% el volumen de cada reactivo.
Nota: El volumen del marcador de tamaño puede ser aumentado o disminuido para ajustar la
intensidad de los picos observados en el electroferograma.
2. Dispensar 18.5 µL de la mezcla anterior en cada pocillo.
3. Añadir 1 µL del ADN obtenido en las reacciones de PCR y TP-PCR.
Nota: El volumen de muestra puede ser aumentado o disminuido (diluyendo las muestras con
agua libre de nucleasas) para ajustar la intensidad de los picos observados en el
electroferograma.
4. Sellar la placa con un film, dar un spin y desnaturalizar en un termociclador durante 5 minutos
a 98ºC.
5. Guardar a 4ºC la placa hasta el momento de introducirla en el secuenciador.
7.3 Electroforesis capilar
Una vez preparada la placa de fragmentos, las reacciones deben ser sometidas a electroforesis
capilar. Dependiendo del modelo de secuenciador utilizado, se emplearán las condiciones de
electroforesis recomendadas por el fabricante.
Para programar las condiciones de electroforesis capilar se debe tener en cuenta que el rango de
amplificación varía aproximadamente entre 100-500 pb, que se emplean cebadores marcados con
6-FAM y que el patrón de peso molecular está marcado con GeneScan
A continuación se muestra una imagen con las condiciones optimizadas para el secuenciador
3730xl DNA Analyzer (ThermoFisher Scientific), usando el polímero POP-7™.
Rev. 5
28/02/2020
Reactivos
Formamida
Marcador GeneScan™ 500 LIZ
Cantidad por reacción
18 µL
0.5 µL
TM
500 LIZ.
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