MERCK Millipore Auto2D Guia De Inicio Rapido página 8

Preparación
Reactivos
1. Prepare y conserve los kits de reactivos
como se indica en el prospecto
suministrado con los kits o en el
manual del usuario completo (virtual).
2. Deje que los siguientes productos
conservados a bajas temperaturas se
equilibren a temperatura ambiente
(20–25 °C aproximadamente 10 minutos).
• Chip de IEF
• Chip de PAGE
• Disolución de rehidratación
• Disolución de DTT
• Anfolito
3. Prepare la disolución de rehidratación de
trabajo para la rehidratación del chip IEF
y la extracción o dilución de la
muestra proteica:
Volu- Concentración
Reactivos men final
Disolución de
189 µL
rehidratación
Disolución de
10 µL 50 mM
DTT (1M)
Anfolito* 1–2 µL 0,5–1 % v/v
Total 200 µL
* Seleccione el anfolito de acuerdo con
el intervalo de pH del chip de IEF que
vaya a utilizar. Para anfolitos a una
concentración madre del 40 %,
añada 1 µL. Para anfolitos a 100X,
añada 2 µL.
4. Prepare el tampón de equilibrio de trabajo
para equilibrar las proteínas separadas
por IEF antes de la separación por
SDS-PAGE.
Volu- Concentración
Reactivos men final
Premezcla del
tampón de
760 µL
equilibrio
Disolución de
40 µL 50 mM
DTT (1M)
Total 800 µL
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Preparación de las muestras
Disuelva la muestra de proteínas en la
disolución de rehidratación de trabajo
preparada según el paso 3. La muestra puede
diluirse dos veces o más con disolución de
rehidratación de trabajo hasta alcanzar la
concentración de proteínas deseada y
disminuir la concentración de sal.
Una concentración elevada de sal puede
afectar a la separación de proteínas durante
el enfoque isoeléctrico y hacer que la corriente
supere los 100 µA. Las muestras con una
elevada concentración de sal deben ser
desaladas mediante:
Precipitación con ácido tricloroacético (TCA)
o acetona y resuspensión de las proteínas
en disolución de rehidratación de trabajo
O
Cambio de tampón utilizando una columna
de centrifugación
NOTA: Durante la resuspensión de las
proteínas, evite el calentamiento de las
proteínas por encima de 37 °C.
Cuantificación de proteínas. Para la
electroforesis en 2D, pueden cargarse entre
0,1 y 25 µg de proteína. La cantidad óptima
de proteína dependerá del método de detección
y de la complejidad de la muestra. Como punto
de partida deberán utilizarse las siguientes
cantidades de proteínas; los usuarios quizá
tengan que optimizar la cantidad cargada en
función de su muestra concreta.
• Tinción con azul brillante Coomassie: 25 µg
• Tinción fluorescente: 10 µg
• Tinción con plata: 5 µg
• Premarcaje fluorescente: 3 µg
El volumen de muestra aplicado al dispositivo
es 10–12 µL. La muestra puede diluirse con
disolución de rehidratación de trabajo según
necesidad.
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Encendido del dispositivo Auto2D
Seleccione el cable de alimentación apropiado
(suministrado con el dispositivo) que sea
compatible con los enchufes de su país.
Encaje firmemente el extremo correspondiente
del cable en la parte trasera del dispositivo
Auto2D y el otro extremo en el enchufe de
®
la luz.
El interruptor de alimentación está situado
cerca del puerto del enchufe de corriente
alterna en la parte posterior del dispositivo
Auto2D . Presione el interruptor hacia arriba
®
para encenderlo.
La aplicación se lanzará automáticamente.
Desde la pantalla, seleccione el modo
Auto2D (original).
®
Carga de una receta
Elija SETTING > RECIPE (CONFIGURACIÓN >
RECETA). Toque la pantalla de información de
recetas. Aparecerá el cuadro de diálogo de
selección de recetas.
Seleccione "RECIPE NAME" > LOAD > OK >
EXIT («NOMBRE DE LA RECETA» > CARGAR >
OK > SALIR).
Nota: confirme que en la parte superior
derecha de la pantalla aparece el nombre
de la receta deseada.
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Montaje de los chips
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Chip de PAGE
Lado del cátodo
Lado del ánodo
1. Retire la cinta blanca del lado del ánodo
del chip.
2. Retire con cuidado la tapa de plástico del
lado del cátodo del chip.
3. Enjuague suavemente con agua destilada
los pocillos para tampón del ánodo y del
cátodo. Utilizando una toallita de papel,
seque con cuidado cualquier líquido que
pueda haber en la parte superior del chip
asegurándose de no dañar la fina tira de
gel localizada en el lado del cátodo
del chip.
Introducción de los chips en
la bandeja
En la pantalla táctil del dispositivo Auto2D
elija OPEN > OK (ABRIR > OK). Una vez
abierta la bandeja, coloque el chip de PAGE
(línea azul clara) con el lado del ánodo
hacia delante. Coloque el chip de disolución
(líneas azul oscuro) en la parte superior del
chip de PAGE con las esquinas recortadas
hacia delantera.
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,
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