Tratamiento De Uracil-N-Glucosilasa (Ung) - Greiner Bio-One PapilloCheck Manual De Instrucciones

8.2.2

Tratamiento de uracil-N-glucosilasa (UNG)

El PapilloCheck PCR MasterMix contiene dUTP, que se incorpora a los productos de la amplificación
®
durante la PCR PapilloCheck
degradación mediante UNG. La UNG divide el producto de la PCR en los sitios donde se ha
incorporado un residuo de desoxiuridilato. Los productos de la PCR divididos no se amplificarán
en una reacción subsiguiente. Por tanto, se puede utilizar un tratamiento de UNG para eliminar la
contaminación cruzada de anteriores reacciones PCR.
Diluya la uracil-N-glucosilasa 1:200 en agua grado PCR. Use una nueva dilución de UNG para
➠
cada reacción PCR PapilloCheck
diluida.
Mezcle la dilución de UNG con cuidado; para hacerlo, mézclela con un Vortex durante 2 segundos
➠
y después centrifúguela, o bien pipetéela arriba y abajo varias veces.
La concentración original de uracil-N-glucosilasa es 1 U/µl. Por consiguiente, la concentración de la
dilución es 0,005 U/µl.
!
El equipo de ensayo PapilloCheck
capítulo 2). Es obligatorio usar esta enzima para lograr el rendimiento establecido.
Añada 1 µl de esta dilución a cada reacción PCR PapilloCheck
➠
Tabla 3).
Esta cantidad es suficiente para eliminar la contaminación cruzada de PCR. Tenga cuidado de no
usar una solución de UNG con mayor concentración, ya que esto podría tener un efecto negativo
sobre el rendimiento de la PCR, lo que reduciría la sensibilidad de PapilloCheck
En general, para el tratamiento de UNG, la mezcla de la reacción PCR se incuba durante 20 minutos
a 37 °C. Después, se inactiva la UNG con un paso de incubación adicional de 15 minutos a 95 °C.
Estos dos pasos ya están incorporados en la PCR PapilloCheck
primeros pasos del programa del termociclador (consulte la tabla 2). Durante el segundo paso
(15 minutos a 95 °C), se producen tanto la inactivación de la uracil-N-glucosilasa como la activación
de la polimerasa HotStarTaq
!
El sistema de UNG incorporado de la PCR PapilloCheck
con productos de la PCR de reacciones PCR anteriores. No se podrá eliminar otro tipo de contaminación,
por ejemplo, la que se produce durante la preparación de las muestras, la extracción de ADN o la adición
de la plantilla de PCR. Por lo tanto, es necesario seguir las instrucciones y las precauciones especiales para
impedir la contaminación, descritas en el capítulo 7.
5 La adquisición de PapilloCheck
5.035.996; 5.683.896; 5.945.313; 6.287.823; y 6.518.026 y las patentes correspondientes en otros países.
6 Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions,
Gene, 93, 125-128, 1990.
PapilloCheck - Manual de instrucciones
®
Revisión: BQ-013-07 / Agosto de 2011
, lo que convierte los productos de la PCR en susceptibles a la
®
preparada (consulte el capítulo 8.2.3). No reutilice la UNG
®
se ha validado con uracil-N-glucosilasa de Fermentas (consulte el
®
.
®
va acompañada de una licencia limitada bajo los números de patente de EE. UU.
®
5
6
(consulte el capítulo 8.2.3,
®
y se corresponden con los dos
®
solamente eliminará la contaminación cruzada
®
.
®
22