Muestras Cervicouterinas 8.2.3 Preparación De La Reacción Pcr - Greiner Bio-One PapilloCheck Manual De Instrucciones

8.2.3 Preparación de la reacción PCR
A excepción de la polimerasa HotStarTaq
ya contiene todos los componentes necesarios para realizar la reacción PCR (tampón de PCR,
MgCl , dNTPs, cebadores, plantilla de control de PCR).
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El equipo de ensayo PapilloCheck
capítulo 2). Es obligatorio usar esta enzima para lograr el rendimiento establecido.
Idealmente, la preparación de la mezcla de reacción se debe realizar en un entorno con protección,
como una campana PCR, para evitar la contaminación de la reacción.
Prepare la mezcla de reacción (compuesta por PapilloCheck
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HotStarTaq y uracil-N-glucosilasa) para la cantidad necesaria de reacciones PCR según lo
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descrito en la Tabla 3.
Para analizar varias muestras, se debe preparar la mezcla de reacción en un lote (en la cantidad
necesaria para todos los análisis). Para adaptarse a las variaciones de volumen durante el pipeteado,
se recomienda aumentar el número de reacciones (n) a tenor de 1 por cada microchip (=n+1), por
ejemplo, prepare un volumen de mezcla de reacción para 13 reacciones de amplificación si se van
a analizar 12 muestras (consulte la tabla 3). Utilice siempre una ampolla de MasterMix para las
reacciones de un microchip.
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Se recomienda incluir un control negativo para cada lote de PapilloCheck
Se pueden usar como control negativo el tampón de elución del ADN del equipo de extracción de ADN
adecuado o agua de categoría PCR.
Mezcle exhaustivamente la mezcla de reacción; para hacerlo, mézclela con un Vortex durante
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2 segundos y después centrifúguela, o bien pipetéela arriba y abajo varias veces.
Divida la mezcla de reacción en alícuotas pipeteando 21 µl de la mezcla de reacción para cada
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reacción PCR en un microtubo para PCR fino de 0,2 ml.
Realice la adición del ADN mensajero en una zona de trabajo diferente a la de la preparación de la
mezcla de reacción (consulte el capítulo 7.2).
Añada 5 µl del ADN extraído a cada reacción PCR y mézclelo con un Vortex durante 2 segundos
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y después centrifúguelo, o bien pipetéelo arriba y abajo varias veces. El volumen total de una
reacción PCR es 26 µl.
Coloque los microtubos en el termociclador e inicie la reacción PCR con el programa del
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termociclador descrito en el capítulo 8.2.1 (Tabla 2).
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Una vez completada la PCR, se deberían usar los productos de la amplificación inmediatamente para la
hibridación, o bien se deberían almacenar a oscuras a -20 °C durante una semana.
PapilloCheck - Manual de instrucciones
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Revisión: BQ-013-07 / Agosto de 2011
y la uracil-N-glucosilasa, el PapilloCheck
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se ha validado con la polimerasa HotStarTaq
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PCR MasterMix
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de Qiagen (consulte el
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PCR MasterMix, polimerasa
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PCR MasterMix preparado.
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