Tabla de contenido
Publicidad
2. Selección del modo de adquisición: XY, XYZ, XYt, XYZt, modo secuencial...
3. Optimización de las condiciones de captura
- Resolución de las imágenes: Son imágenes de 12 bits (4096 niveles de grises). La
resolución espacial depende de la óptica y zoom utilizados. En principio, el muestreo
correcto debería cumplir el criterio de Nyquist. Sin embargo, en muchas ocasiones, esto
conlleva, mayor tiempo de captura, mayor tamaño de las imágenes, mayor apagamiento
del fluorocromo, etc. Normalmente capturamos imágenes de 1024x1024 pixels para
modo XY y de 512x512 para modo XYZ, XYt, XYZt.
- Intensidades habituales de cada láser. La apertura del AOTF por defecto para cada
uno de los láseres es la siguiente:
LD 405 nm: 10%
Multi Argon a 488 nm: 10-25%
HeNe G 543nm: 80%
HeNe R 633nm: 50-80 %
Estas intensidades se pueden modificar fácilmente.
- Sensibilidad de los detectores: Para variar la sensibilidad de cada
fotomultiplicador se puede trabajar con 3 parámetros: el voltaje, el gain y el offset. El
rango de voltaje de los fotomultiplicadores con los que trabajamos habitualmente está
en torno a 450-600 v. En base a nuestra experiencia, si la señal es muy tenue en los
oculares, será difícil obtener una imagen decente, el confocal no hace milagros. Por
encima de 700v la señal no es muy fiable. Hay que tener todos los controles negativos
necesarios. El offset es muy útil para muestras con bastante ruido de fondo (por
ejemplo, secciones histológicas gruesas).
- Captura secuencial: En caso de tener sobrecruzamiento de espectros de emisión
entre los fluorocromos utilizados, se realiza una excitación y captura en modo
secuencial de cada uno de los fluorocromos. Muy útil en estudios de colocalización.
- Zoom: El confocal dispone de un zoom bastante eficiente y de gran utilidad.
Básicamente, lo que hace al aumentar el zoom es disminuir el área de barrido y obtener
el mismo número de puntos (pixels) del área scaneada, aumentando la resolución de la
imagen utilizando el mismo objetivo. Siguiendo el criterio de Nyquist, para cada
objetivo y cada resolución de captura existe un nivel de zoom a partir del cual no se
aumenta la resolución.
4. Captura de imágenes
Una vez configuradas las condiciones de adquisición, se aprieta una vez al botón de
capturar, que aparecerá como XY, XYZ, etc., dependiendo del modo de captura
seleccionado. Cuando está capturando no se debe tocar nada del equipo, ni mover el
microscopio.
5. Procesamiento y almacenamiento de imágenes
Una vez capturada la imagen, ésta se guarda en formato multitif que, además de las
imágenes, posee toda la información acerca de la configuración del equipo durante la
adquisición.
web:
http://www.ehu.es/SGIker
e-mail:
sgmicromed@ehu.es
Tel. 946015793
8
Publicidad
Tabla de contenido
