Microscopia In Campo Scuro; Principi Di Microscopia Con Immersione In Olio - Optika Italy B-510 Serie Manual De Instrucciones

12. Microscopia in campo scuro

Il B-510DK è un microscopio per osservazione in campo scuro specifico per l'analisi del sangue con uno speciale
condensatore per campo scuro extra efficiente, con A.N. da 1.36 a 1.25 e un obiettivo plan acromatico da 100x con
diaframma regolabile.
L'illuminazione a LED X garantisce l'alto livello di intensità della luce tipicamente necessario nelle tecniche campo scuro
ad alto ingrandimento.
Per utilizzare correttamente questo microscopio, è necessario acquisire familiarità con:
a. la tecnica di immersione in olio
b. la tecnica di campo scuro.
Nel seguente manuale vengono introdotte le basi di questi metodi (paragrafi 12.1 e 12.2) ed anche una guida passo-passo
alla configurazione del B-510DK (paragrafo 12.4).
Vengono forniti anche consigli generali per la microscopia a immersione.
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Principi di microscopia con immersione in olio

La capacità dell'obiettivo del microscopio di catturare i raggi di luce deviati da un campione dipende sia dall'apertura
numerica sia dal mezzo attraverso cui la luce viaggia.
L'apertura numerica di un obiettivo è direttamente proporzionale
all'indice di rifrazione del mezzo tra il coprioggetto e la lente frontale,
e anche al seno di metà dell'apertura angolare dell'obiettivo.
Poiché il seno non può essere maggiore di 90 gradi, l'apertura
numerica massima possibile è determinata dall'indice di rifrazione
del mezzo di immersione.
La maggior parte degli obiettivi di un microscopio utilizza l'aria
come mezzo attraverso il quale i raggi di luce devono passare
tra il coprioggetto che protegge il campione e la lente frontale
dell'obiettivo. Gli obiettivi di questo tipo vengono definiti obiettivi
a secco perché vengono utilizzati senza mezzi intermedi liquidi.
L'aria ha un indice di rifrazione di 1.0003, molto vicino a quello
del vuoto e considerevolmente inferiore alla maggior parte dei
liquidi, tra cui acqua (n = 1.33), glicerina (n = 1.470) e comuni oli
da immersione al microscopio (media n = 1.515).
In pratica, l'apertura numerica massima di un sistema di obiettivi a
secco è limitata a 0,95 e valori maggiori possono essere raggiunti
solo utilizzando l'ottica progettata per il mezzo di immersione.
Il principio dell'immersione in olio è dimostrato in Fig. 21 dove i
singoli raggi di luce sono tracciati attraverso il campione e passano
nell'obiettivo o sono rifratti in altre direzioni. La Fig. 21(a) illustra il
caso di un obiettivo secco con cinque raggi (etichettati da 1 a 5)
mostrati passando attraverso un campione coperto con un vetrino
coprioggetto. Questi raggi sono rifratti nell'interfaccia vetrino-aria
e solo i due raggi più vicini all'asse ottico del microscopio (raggi
1 e 2) hanno l'angolo appropriato per entrare nella lente frontale
obiettivo. Il terzo raggio viene rifratto con un angolo di circa 30
gradi rispetto al coprioggetto e non entra nell'obiettivo. Gli ultimi due raggi (4 e 5) sono riflessi internamente indietro
attraverso il coprioggetto e, insieme al terzo raggio, contribuiscono a riflessi interni di luce su superfici di vetro che tendono
a degradare la risoluzione dell'immagine.
Quando l'aria viene sostituita dall'olio con lo stesso indice di rifrazione del vetro, mostrato nella Fig. 21(b), i raggi luminosi
passano direttamente attraverso l'interfaccia vetro-olio senza deviazione dovuta alla rifrazione. L'apertura numerica è
quindi aumentata dal fattore di n, l'indice di rifrazione dell'olio.
Gli obiettivi da microscopio progettati per l'uso con l'olio per immersione hanno una serie di vantaggi rispetto a quelli
utilizzati a secco. Gli obiettivi di immersione sono tipicamente di correzione superiore (fluorite o apocromatica) e possono
avere aperture numeriche funzionanti fino a 1.40 quando vengono utilizzati con olio ad immersione avente la dispersione
e la viscosità appropriate.
Questi obiettivi consentono di aprire il diaframma del condensatore in misura maggiore, estendendo così l'illuminazione del
campione e sfruttando l'apertura numerica aumentata.
Un fattore che viene comunemente trascurato quando si usano obiettivi ad immersione in olio di apertura numerica
aumentata sono le limitazioni poste sul sistema dal condensatore.
In una situazione in cui un obiettivo ad olio con A.N. = 1.40 viene utilizzato per osservare un campione con un condensatore
di apertura numerica più piccola (1.0 per esempio), l'apertura numerica inferiore del condensatore sovrascrive quella
dell'obiettivo e la A.N. totale del sistema è limitata a 1.0 (l'apertura numerica del condensatore).
Immersione in olio e Apertura Numerica
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