Microscopie En Fond Noir; Principes De La Microscopie À Immersion Dans L'huile - Optika Italy B-510 Serie Manual De Instrucciones

12. Microscopie en fond noir

Le B-510DK est un système à fond noir spécifique pour l'analyse sanguine avec un condenseur spécial à fond noir de 1,36
à 1,25 N.A. et un objectif plan-achromatique 100X à diaphragme iris réglable.
L'éclairage X-LED assure le haut niveau d'intensité lumineuse généralement nécessaire dans les techniques de fond noir
à fort grossissement.
Pour utiliser correctement ce microscope, il faut se familiariser avec:
a. technique d'immersion dans l'huile
b. la technique du fond noir.
Dans le manuel suivant, nous présentons les bases de ces méthodes (chapitres 12.1 et 12.2), puis nous donnons un guide
étape par étape de la configuration du B-510DK (chapitre 12.4).
Des conseils généraux pour la microscopie par immersion sont également donnés.
12.1 Principes de la microscopie à immersion dans l'huile
La capacité d'un objectif de microscope à capturer les rayons lumineux déviés d'un échantillon dépend à la fois de l'ouver-
ture numérique et du milieu dans lequel la lumière voyage.
L'ouverture numérique d'un objectif est directement proportion-
nelle à l'indice de réfraction du milieu d'imagerie entre la lamelle
de protection et la lentille frontale, ainsi qu'au péché de la moitié de
l'ouverture angulaire de l'objectif.
Comme le péché ne peut être supérieur à 90 degrés, l'ouverture
numérique maximale possible est déterminée par l'indice de ré-
fraction du milieu d'immersion.
La plu part des objectifs de microscope utilisent l'air comme mi-
lieu à travers lequel les rayons lumineux doivent passer entre la
lamelle protégeant l'échantillon et la lentille avant de l'objectif. Les
objectifs de ce type sont appelés objectifs secs parce qu'ils sont
utilisés sans milieu d'imagerie liquide.
L'air a un indice de réfraction de 1.0003, très proche de celui du
vide et considérablement inférieur à celui de la plu part des liquides,
y compris l'eau (n = 1.33), la glycérine (n = 1.470) et les huiles à
immersion courantes pour microscope (moyenne n = 1.515).
En pratique, l'ouverture numérique maximale d'un système d'ob-
jectif sec est limitée à 0.95, et des valeurs supérieures ne peuvent
être obtenues qu'en utilisant des optiques conçues pour des mi-
lieux d'immersion.
Le principe de l'immersion dans l'huile est démontré à la Fig. 21,
où des rayons lumineux individuels sont tracés à travers l'échantil-
lon et passent dans l'objectif ou sont réfractés dans d'autres direc-
tions. La Fig. 21(a) illustre le cas d'un objectif sec avec cinq rayons
(étiquetés de 1 à 5) passant à travers un échantillon recouvert
d'une lamelle. Ces rayons sont réfractés à l'interface coverslip-air
et seuls les deux rayons les plus proches de l'axe optique (rayons
1 et 2) du microscope ont l'angle approprié pour pénétrer dans
la lentille frontale de l'objectif. Le troisième rayon est réfracté à
un angle d'environ 30 degrés par rapport à la lamelle et n'entre pas dans l'objectif. Les deux derniers rayons (4 et 5) sont
réfléchis à l'intérieur de la lamelle et, avec le troisième rayon, contribuent à la réflexion interne de la lumière sur les surfaces
vitrées qui ont tendance à dégrader la résolution des images. Lorsque l'air est remplacé par de l'huile ayant le même indice
de réfraction que le verre, comme le montre la Fig. 21(b), les rayons lumineux passent maintenant directement à travers
l'interface verre-huile sans déviation due à la réfraction. L'ouverture numérique est ainsi augmentée du facteur n, l'indice
de réfraction de l'huile.
Les objectifs de microscope conçus pour être utilisés avec de l'huile d'immersion présentent un certain nombre d'avantages
par rapport à ceux qui sont utilisés à sec. Les objectifs d'immersion sont généralement de plus grande correction (fluorite ou
apochromatique) et peuvent avoir des ouvertures numériques de travail jusqu'à 1.40 lorsqu'ils sont utilisés avec une huile
d'immersion ayant la dispersion et la viscosité appropriées. Ces objectifs permettent d'ouvrir davantage le diaphragme
du condenseur de sous-étage, ce qui permet d'étendre l'éclairage de l'échantillon et de profiter de l'ouverture numérique
accrue.
Un facteur souvent négligé lors de l'utilisation d'objectifs d'immersion d'huile à ouverture numérique accrue est la limitation
du système par le condenseur de sous-étage.
Immersion dans l'huile et Ouverture
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Numérique
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