Principios De Iluminación De Campo Oscuro - Optika Italy B-510 Serie Manual De Instrucciones

12.2 Principios de iluminación de campo oscuro
La microscopía de campo oscuro es una técnica de iluminación
especializada que aprovecha la iluminación oblicua para
mejorar el contraste en muestras que no son bien visualizadas
bajo condiciones normales de iluminación de campo claro.
Todos nosotros estamos bastante familiarizados con la
apariencia y la visibilidad de las estrellas en una noche oscura,
a pesar de su enorme distancia de la tierra. Las estrellas se
pueden ver debido al marcado contraste entre su tenue luz y
el cielo negro.
Este principio se aplica en la microscopía de campo oscuro
(también llamada de fondo oscuro), un método simple y popular
para hacer que los objetos no manchados sean claramente
visibles. Estos objetos suelen tener índices de refracción muy
cercanos a los de su entorno y son difíciles de visualizar en
la microscopía de campo claro convencional. Por ejemplo,
muchos organismos acuáticos pequeños tienen un índice de
refracción que oscila entre 1,2 y 1,4, lo que resulta en una
diferencia óptica insignificante con respecto al medio acuoso
circundante. Estos son candidatos ideales para la iluminación
de campo oscuro.
La iluminación de campo oscuro requiere bloquear la luz
central que normalmente pasa a través y alrededor del
espécimen, permitiendo que sólo los rayos oblicuos de cada
acimut "golpeen" el espécimen montado en el portaobjetos del
microscopio. La lente superior de un simple condensador de
campo oscuro de Abbe es esféricamente cóncava, permitiendo
que los rayos de luz que emergen de la superficie en todos
los acimutes formen un cono hueco invertido de luz con un
ápice centrado en el plano de la muestra. Si no hay ningún
espécimen presente y la apertura numérica del condensador
es mayor que la del objetivo, los rayos oblicuos se cruzan y
todos estos rayos no podrán entrar en el objetivo debido a su oblicuidad. El campo de visión aparecerá oscuro.
El par condensador de campo oscuro / objetivo ilustrado en la Fig. 23 es una disposición de apertura numérica alta
que representa la microscopía de campo oscuro en su configuración más sofisticada, que se discutirá en detalle más
adelante. El objetivo contiene un diafragma interno de iris que sirve para reducir la apertura numérica del objetivo a un
valor inferior al del cono de luz hueco invertido emitido por el condensador. El condensador cardioide es un diseño de
campo oscuro reflectante que se basa en espejos internos para proyectar un cono de luz libre de aberraciones sobre el
plano de la muestra.
Cuando se coloca un espécimen en el portaobjetos, especialmente un espécimen no manchado y no absorbente de luz,
los rayos oblicuos atraviesan el espécimen y son difractados, reflejados y/o refractados por discontinuidades ópticas
(tales como la membrana celular, el núcleo y los orgánulos internos) que permiten que estos rayos tenues entren en el
objetivo. El espécimen puede entonces verse brillante sobre un fondo que de otro modo sería negro. En términos de
óptica de Fourier, la iluminación de campo oscuro elimina el orden de cero (luz no dispersa) del patrón de difracción
formado en el plano focal trasero del objetivo. Esto da como resultado una imagen formada exclusivamente a partir de
intensidades de difracción de orden superior dispersas por el espécimen.
Los candidatos ideales para la iluminación de campo oscuro incluyen organismos acuáticos vivos diminutos, diatomeas,
insectos pequeños, huesos, fibras, cabello, bacterias no manchadas, levaduras y protozoos.
Los especímenes no biológicos incluyen cristales minerales y químicos, partículas coloidales, especímenes de conteo de
polvo y secciones delgadas de polímeros y cerámicas que contienen pequeñas inclusiones, diferencias de porosidad o
gradientes de índice de refracción.
Se debe tener cuidado al preparar las muestras para la microscopía de campo oscuro, ya que las características que se
encuentran por encima y por debajo del plano de enfoque también pueden dispersar la luz y contribuir a la degradación
de la imagen.
El espesor del espécimen y el espesor del portaobjetos del microscopio también son muy importantes y, en general,
es deseable una muestra delgada para eliminar la posibilidad de artefactos de difracción que puedan interferir con la
formación de imágenes.
Objetivo de
alta Apertura
Numérica
Cono de
luz oblicua
Espejo
cóncavo
Luz de la
fuente
Condensador cardioide para campo oscuro
Página 71
Luz a los oculares
Diafragma Iris
Muestra
Condensador
cardioide
Espejo
Convexo
Diaframma
Centrale
F ig. 23 F ig. 23