Microscopía De Campo Oscuro; Principios De Microscopía A Inmersión En Aceite - Optika Italy B-510 Serie Manual De Instrucciones

12. Microscopía de campo oscuro
El B-510DK es un sistema de campo oscuro específico para el análisis de sangre con un condensador de campo oscuro
1.36 - 1.25 A.N. especial extra eficiente y un objetivo plan-acromático 100X con diafragma de iris ajustable.
La iluminación X-LED garantiza el alto nivel de intensidad de luz que normalmente se necesita en las técnicas de campo
oscuro de gran aumento.
Para utilizar correctamente este microscopio, hay que familiarizarse con él:
a. técnica de inmersión en aceite
b. técnica de campo oscuro.
En el siguiente manual se presentan las bases de estos métodos (capítulos 12.1 y 12.2) y a continuación se ofrece una
guía paso a paso de la configuración del B-510DK (capítulo 12.4).
También se dan consejos generales para la microscopía de inmersión.
12.1 Principios de microscopía a inmersión en aceite
La capacidad de un objetivo de microscopio para capturar los rayos de luz desviados de una muestra depende tanto de
la apertura numérica como del medio a través del cual viaja la luz.
La apertura numérica de un objetivo es directamente proporcional
al índice de refracción del medio de imagen entre la cubreobjetos
y la lente frontal, y también al pecado de la mitad de la apertura
angular del objetivo.
Debido a que el pecado no puede ser mayor de 90 grados, la aper-
tura numérica máxima posible se determina por el índice de refrac-
ción del medio de inmersión.
La mayoría de los objetivos del microscopio utilizan el aire como
el medio a través del cual los rayos de luz deben pasar entre el
cubreobjetos, protegiendo la muestra y la lente frontal del objetivo.
Los objetivos de este tipo se denominan objetivos secos porque se
utilizan sin medios líquidos de imagen.
El aire tiene un índice de refracción de 1.0003, muy cercano al del
vacío y considerablemente inferior al de la mayoría de los líquidos,
incluyendo el agua (n = 1.33), la glicerina (n = 1.470) y los aceites
de inmersión comunes para microscopios (media n = 1.515).
En la práctica, la apertura numérica máxima de un sistema de ob-
jetivo seco está limitada a 0.95, y los valores mayores sólo pueden
lograrse utilizando ópticas diseñadas para medios de inmersión.
El principio de la inmersión en aceite se muestra en la Fig. 21, don-
de los rayos de luz individuales se trazan a través de la muestra y
pasan al objetivo o se refractan en otras direcciones. La Fig. 21(a)
ilustra el caso de un objetivo seco con cinco rayos (marcados del
1 al 5) que pasan a través de una muestra que está cubierta con
un cubreobjetos. Estos rayos se refractan en la interfase coverslip-
aire y sólo los dos rayos más cercanos al eje óptico (rayos 1 y 2)
del microscopio tienen el ángulo apropiado para entrar en la lente
frontal del objetivo. El tercer rayo se refracta en un ángulo de unos 30 grados con respecto al cubreobjetos y no entra
en el objetivo. Los dos últimos rayos (4 y 5) se reflejan internamente a través del cubreobjetos y, junto con el tercer rayo,
contribuyen a la reflexión interna de la luz en las superficies de cristal que tienden a degradar la resolución de la imagen.
Cuando el aire es reemplazado por aceite del mismo índice de refracción que el vidrio, como se muestra en la Fig. 21(b),
los rayos de luz pasan directamente a través de la interfaz vidrio-aceite sin desviarse debido a la refracción. La apertura
numérica se incrementa así por el factor n, el índice de refracción del aceite.
Los objetivos del microscopio diseñados para su uso con aceite de inmersión tienen una serie de ventajas sobre los que
se utilizan en seco. Los objetivos de inmersión son típicamente de mayor corrección (ya sea fluorita o apocromática) y pue-
den tener aperturas numéricas de trabajo de hasta 1.40 cuando se usan con aceite de inmersión que tenga la dispersión y
viscosidad adecuadas. Estos objetivos permiten que el diafragma del condensador se abra en mayor grado, extendiendo
así la iluminación de la muestra y aprovechando el aumento de la apertura numérica.
Un factor que comúnmente se pasa por alto cuando se utilizan objetivos de inmersión en aceite de mayor apertura numé-
rica son las limitaciones impuestas al sistema por el condensador .
En una situación en la que se utiliza un objetivo de aceite de A.N. = 1.40 para obtener imágenes de un espécimen con un
condensador de menor apertura numérica (1.0 por ejemplo), la apertura numérica más baja del condensador prevalece
sobre la del objetivo y la A.N. total del sistema se limita a 1.0, la apertura numérica del condensador.
Inmersión en aceite y Apertura numérica
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