Qiagen ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Manual página 19

Antes de comenzar
Prepare el tampón RLT (suministrado con el kit RNeasy Midi (QIAGEN,

n.º de referencia 75144)/β-mercaptoetanol (β-ME): añada 10 µl de β-ME
por 1 ml de tampón RLT. El tampón RLT permanece estable durante 1 mes
después de añadir β-ME.
Nota: el β-ME es tóxico; dispénselo en una campana de gases y utilice el
equipo de protección adecuado.
Procedimiento
1. Añada 40 ml de tampón para lisis de eritrocitos a 10 ml de sangre total en
un solo tubo de centrífuga de 50 ml. Mezcle invirtiendo el tubo brevemente.
2. Deje incubar durante 15 minutos sobre hielo. Mezcle invirtiendo el tubo
brevemente en dos ocasiones durante la incubación.
Nota: la suspensión turbia se torna translúcida durante la incubación, lo
que indica la lisis de los glóbulos rojos.
3. Centrifugue a 400 × g durante 10 minutos a 4 °C. Deseche completamente
el sobrenadante. Guarde el sedimento de leucocitos.
Nota: los leucocitos formarán un sedimento después de la centrifugación.
Asegúrese de eliminar por completo el sobrenadante. Las trazas de
glóbulos rojos que puedan quedar presentes se eliminan en los pasos
siguientes.
Una eliminación incompleta del sobrenadante inhibe la lisis y diluye el
lisado, lo que interfiere en las condiciones de unión del ARN a la
membrana RNeasy. Ambos efectos pueden reducir la liberación de ARN.
4. Añada 20 ml de tampón para lisis de eritrocitos al sedimento de leucocitos
y resuspenda pipeteando hacia arriba y abajo.
5. Centrifugue a 400 × g durante 10 minutos a 4 °C. Deseche completamente
el sobrenadante. Guarde el sedimento de leucocitos.
Nota: los siguientes pasos de centrifugación (p. ej., aislamiento de ARN)
deben realizarse a 20-25 °C.
6. Resuspenda el sedimento de leucocitos añadiendo 4 ml de tampón RLT
suplementando con β-ME y dando golpecitos con el dedo en el tubo e
invirtiéndolo. Mezcle mediante agitación o pipeteo.
Nota: asegúrese de que se ha añadido β-ME al tampón RLT antes de
utilizarlo.
Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014 19