Aislamiento De Arn Total - Qiagen ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Manual

7. Para garantizar la rotura celular, utilice un homogeneizador de rotor y
estator durante 45 segundos como mínimo a máxima velocidad hasta que
la muestra quede uniformemente homogénea. También existe la posibilidad
de agitar la muestra durante 10 segundos y hacer pasar el lisado 10 veces
como mínimo a través de una aguja calibre 18-20 conectada a una jeringa
exenta de RNasa.
Nota: una rotura incompleta reducirá significativamente el proceso de
liberación al obstruir la columna RNeasy. La rotura celular mediante
homogeneizadores de rotor y estator suele obtener un mayor rendimiento
total de ARN en comparación con otros métodos de homogenización.
Nota: las muestras pueden almacenarse a una temperatura comprendida
entre –65 y –90 °C en tampón de lisis después de la rotura. Las muestras
congeladas permanecen estables durante meses.

Aislamiento de ARN total

Este protocolo está diseñado para el aislamiento de ARN celular total a partir
de lisado de leucocitos homogeneizado resuspendido en 4 ml de RLT/β-ME.
Notas importantes antes de comenzar
No se requiere la digestión de la DNasa puesto que la tecnología de

membrana de sílice RNeasy elimina eficazmente la mayor parte de ADN.
El tampón RLT y el tampón RW1 contienen sal de guanidina y, por lo tanto,

no son compatibles con reactivos desinfectantes que contengan lejía. La
guanidina es un compuesto irritante. Adopte las medidas de seguridad
adecuadas y utilice guantes para su manipulación.
El protocolo de RNeasy debe realizarse a temperatura ambiente. Durante

el procedimiento, trabaje con rapidez.
Todos los pasos de centrifugación se realizan a 20-25 °C. Asegúrese de

que la centrífuga no se enfría por debajo de 20 °C.
En cada paso de centrifugación, todo el volumen debe hacerse pasar a

través de la columna. Puede resultar necesario repetir la centrifugación.
Antes de comenzar
En caso necesario, descongele el lisado de leucocitos a temperatura

ambiente antes de empezar el protocolo de aislamiento de ARN.
Prepare 4 ml de etanol al 70% para cada muestra.

20 Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014