Principio Del Procedimiento - Qiagen ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Manual

Principio del procedimiento

La técnica de PCR cuantitativa permite la cuantificación precisa de los pro-
ductos de la PCR durante la fase exponencial del proceso de amplificación
de la PCR. Es posible la obtención rápida de datos cuantitativos de la PCR sin
necesidad de su procesamiento posterior mediante la detección en tiempo real
de señales fluorescentes durante los ciclos de la PCR, o después, reduciendo así
considerablemente el riesgo de contaminación con productos de la PCR.
Actualmente existen 3 tipos principales de técnicas de qPCR: análisis de qPCR
con fluoróforo SYBR Green I, análisis de qPCR con sondas de hidrólisis y
®
análisis de qPCR con sondas de hibridación.
Este ensayo se centra en el principio de la hidrólisis de oligonucleótidos de la
qPCR con doble fluoróforo. Durante la PCR, los primers directos e inversos se
hibridan con una secuencia específica. La mezcla contiene un oligonucleótido
con doble fluoróforo. Esta sonda, formada por un oligonucleótido marcado con
un fluoróforo indicador en el extremo 5' y un fluoróforo supresor en sentido
descendente en el extremo 3', se hibrida con una secuencia objetivo dentro del
producto de la PCR. El análisis de qPCR con sondas de hidrólisis se basa en la
actividad de la exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa Thermus aquaticus
(Taq). Cuando la sonda está intacta, la proximidad del fluoróforo indicador al
fluoróforo supresor provoca la supresión de la fluorescencia del indicador
debido principalmente a la transferencia de energía de tipo Förster.
Durante la PCR, si el objetivo que nos interesa está presente, la sonda hibrida
específicamente entre el primer directo y el inverso. La actividad de la
exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa escinde la sonda entre el indicador
y el supresor solo si la sonda se hibrida con el objetivo. A continuación, los
fragmentos de la sonda se separan del objetivo y continúa la polimerización
de la hebra. Se bloquea el extremo 3' de la sonda para evitar la extensión de
la misma durante la PCR (ilustración 2). Esto ocurre en cada ciclo y no interfiere
en la acumulación exponencial del producto.
El aumento de la señal de fluorescencia se detecta únicamente si la secuencia
objetivo es complementaria a la sonda y, por consiguiente, se amplifica
durante la PCR. De acuerdo con estos requisitos, la amplificación no específica
no se detecta. Por lo tanto, el aumento de la fluorescencia es directamente
proporcional a la amplificación del objetivo durante la PCR.
8 Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014