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10. Es importante secar la membrana de la columna de centrifugado puesto
que los restos de etanol pueden interferir en las reacciones posteriores.
Centrifugar las columnas de centrifugado con las tapas abiertas evita el
arrastre de etanol durante la elución de ARN.
11. Sitúe la columna de centrifugado RNeasy MinElute en un tubo de recogida
de 1,5 ml nuevo (suministrado).
12. Añada 20 µl de agua libre de RNasa directamente en el centro de la
membrana de la columna de centrifugado. Cierre la tapa con suavidad
y centrifugue durante 1 minuto a máxima velocidad para eluir el ARN.
13. Cuando se haya completado el paso de elución, coloque las muestras sobre
hielo.
14. Mida el volumen de las muestras que se utilizarán y ajústelo de modo que
la concentración final sea de 200 ng/µl.
En caso necesario, consulte "Cualificación y cuantificación del ARN", en la
página 22, para obtener más información al respecto.
Transcripción inversa
Antes de comenzar
Descongele todos los componentes necesarios salvo la transcriptasa inversa,
que se debe mantener en el congelador cuando no se utilice. Coloque los
tubos que contienen los componentes que se deben descongelar en hielo.
Nota: no tarde más de 30 minutos en llevar a cabo la descongelación
para evitar la degradación de los materiales.
Limpie la zona de trabajo dedicada a la preparación de la mezcla de
transcripción inversa (TI) para asegurarse de que no se contaminan los
moldes ni las nucleasas.
Mezcle bien pipeteando hacia arriba y abajo 10 veces los tubos que
contienen los reactivos de transcripción inversa, las muestras de ARN, los
controles positivos y el calibrador IS-MMR y centrifúguelos brevemente antes
de utilizarlos. A continuación, consérvelos en hielo.
El control negativo para la transcripción inversa se genera durante el paso
de transcripción inversa utilizando agua libre de nucleasas de calidad PCR.
La cantidad necesaria es de 3 µg de ARN por muestra.
El kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR contiene reactivos suficientes
para realizar 3 series analíticas de 8 muestras.
Manual del kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR 12/2014
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