Beckman Coulter IM3632 Manual De Instrucciones página 121

IMPORTANTE:
Resumo da preparação (rótulo do tubo: TROL45/34/7-AAD)
Reagentes e amostras
CD45-FITC/CD34-PE
Corante 7-AAD para verificação de
viabilidade
Sangue total
Células de controle Stem-Trol
Vórtex — Incube à temperatura ambiente por 20 minutos. Proteja contra a luz
Solução de lise com NH
Vórtex — Incube à temperatura ambiente por 10 minutos. Proteja contra a luz
Fluoroesferas Stem-Count
MÉTODO DE ANÁLISE E DELIMITAÇÃO MANUAL
Configuração do protocolo
O citômetro de fluxo deve estar equipado para detectar dispersão direta, dispersão lateral e quatro canais de
fluorescência. Para o canal FL3 (para o monitoramento de fluoroesferas Stem-Count ou Flow-Count) use um filtro
de passagem de banda de 620 nm. Para o canal FL4 (para o monitoramento do corante de viabilidade 7-AAD),
use um filtro de passagem longo de 675 nm.
OBSERVAÇÃO: O mesmo esquema de delimitação e séries de 8 histogramas, conforme indicado para a
análise de espécimes, deve ser seguido para as células de controle Stem-Trol. Como as
células de controle Stem-Trol têm características de tamanho semelhantes e expressam
antígenos CD45 e CD34 em densidades que se aproximam de células hematopoiéticas
imaturas normais, não há necessidade de modificar os limites da região ao longo dos
canais de Dispersão direta, Fluorescência 1 e Fluorescência 2. Contudo, como as
características de dispersão lateral das células de controle Stem-Trol são únicas, você
pode ajustar os limites da região ao longo da dispersão lateral. As regiões A, B, C e D
(veja o título "Criação de regiões" para a definição da região) devem ser modificadas
para incluir o agrupamento característico das células de controle Stem-Trol.
Criação dos histogramas
Crie histogramas da seguinte forma:
1. Crie o Histograma 1 como FL1 CD45-FITC vs. dispersão lateral.
2. Crie o Histograma 2 como FL2 CD34-PE vs. dispersão lateral.
3. Crie o Histograma 3 como FL1 CD45-FITC vs. dispersão lateral.
4. Crie o Histograma 4 como dispersão direta vs. dispersão lateral.
5. Crie o Histograma 5 como FL1 CD45-FITC vs. FL2 CD34-PE.
6. Crie o Histograma 6 como dispersão direta vs. dispersão lateral.
7. Crie o Histograma 7 como tempo vs. fluoroesferas FL3 Stem-Count ou Flow-Count.
8. Crie o Histograma 8 como FL4 7-AAD vs. dispersão lateral.
Os Histogramas 1 a 4 destinam-se a caracterizar HPC CD34
análise. Estes primeiros quatro histogramas são configurados de acordo com ISHAGE Guidelines for CD34
Determination by Flow Cytometry (Diretrizes ISHAGE para a determinação de células CD34+ por citometria de
fluxo) (2,3).
Os histogramas 5 a 7 destinam-se a monitorar parâmetros importantes durante a etapa de aquisição. Isso inclui
o discriminador de dispersão direta, o número de eventos CD45
fluoroesfera corretos.
O Histograma 8 destina-se a discriminar e analisar eventos viáveis a partir de eventos não viáveis quando exigido.
B60231–AE
Há risco de resultados errados se a amostra for analisada mais de 1 hora após a adição
de fluoroesferas Stem-Count ou Flow-Count. As amostras preparadas devem ser
analisadas até 1 hora após a adição de fluoroesferas Stem-Count ou Flow-Count.
Cl 1x
4
Volume
20 µL
20 µL
100 µL
20 µL
2 mL
100 µL
, um processo que pode ser adiado até a etapa de
+
a serem coletados e o acúmulo de singletos de
+
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Cell
+