Beckman Coulter IM3632 Manual De Instrucciones página 33

IMPORTANTE:
9. Mezcle suavemente las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres dando vuelta al frasco de 3 a 5 veces antes
de su utilización. Evite mezclar en exceso a fin de reducir al máximo la formación de burbujas de aire.
10.Antes de la adquisición, pipetee 100 µL de Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres en el tubo de muestra.
11. Mezcle en vórtex durante 5 segundos inmediatamente después de cada adición. Conserve a una temperatura
entre 2 y 8 °C. Repita la mezcla en vórtex inmediatamente antes de cada adquisición por citometría de flujo.
IMPORTANTE:
Resumen de la preparación (Etiqueta del tubo de muestra: TROL45/34/7-AAD)
Reactivos y muestras
CD45-FITC / CD34-PE
Colorante 7-AAD - Viabilidad celular
Sangre entera
Stem-Trol Control Cells
Vórtex – Incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Protéjase de la luz
1X NH Cl Lysing Solution
4
Vórtex – Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Protéjase de la luz
Stem-Count Fluorospheres
MÉTODO MANUAL DE DELIMITACIÓN DE LAS VENTANAS Y DE ANÁLISIS
Configuración del protocolo de análisis
El citómetro de flujo debe estar equipado para detectar dispersión de luz frontal, dispersión lateral de luz y cuatro
canales de fluorescencia. Para el canal FL3 (para la detección de las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres)
utilice un filtro band pass 620 nm. Para el canal FL4 (para la detección del marcador de viabilidad 7-AAD) utilice
un filtro long pass 675 nm.
NOTA: En el caso de las Stem-Trol Control Cells, debe aplicarse el mismo método de análisis
de ventanas y la serie de 8 histogramas tal y como se indica para el análisis de
muestras. Dado que las Stem-Trol Control Cells tienen características de tamaño
similares y expresan los antígenos CD45 y CD34 con densidades parecidas a las
células hematopoyéticas inmaduras normales, no hay necesidad de modificar los
contornos de la región a lo largo de la dispersión de luz frontal y los canales de
fluorescencia 1 y 2. Sin embargo, puesto que las características de la dispersión lateral
de las Stem-Trol Control Cells son singulares, se pueden ajustar los contornos de la
región en la dispersión lateral. Las regiones A, B, C y D (para conocer la definición de
una región, consulte la sección Creación de las regiones) se deben modificar para incluir
las características de agrupamiento de las Stem-Trol Control Cells.
Creación de los Histogramas:
Cree histogramas del modo siguiente:
1. Crear un Histograma 1 con FL1 CD45-FITC frente a dispersión lateral de luz.
2. Crear un Histograma 2 con FL2 CD34-PE frente a dispersión lateral de la luz.
3. Crear un Histograma 3 con FL1 CD45-FITC frente a dispersión lateral de luz.
4. Crear un Histograma 4 con dispersión frontal de luz frente a dispersión lateral de luz.
5. Crear un Histograma 5 con FL1 CD45-FITC frente a FL2 CD34-PE.
6. Crear un Histograma 6 con dispersión frontal frente a dispersión lateral.
B60231–AE
Existe riesgo de resultados erróneos si se pipetean burbujas de aire. La mezcla en
exceso de Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres puede provocar la formación de
burbujas de aire. Evite mezclar en exceso las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres
y no pipetee las burbujas de aire dentro de los tubos de muestra que contienen los
tubos de muestra.
Existe un riesgo de resultados erróneos si las muestras se analizan más de una
hora después de añadir las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres. Las muestras
preparadas deben de analizarse dentro de una hora después de añadir las Stem-Count
o Flow-Count Fluorospheres.
Volumen
20 µL
20 µL
100 µL
20 µL
2 mL
100 µL
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