Beckman Coulter IM3632 Manual De Instrucciones página 27

Creazione delle Regioni
Creare le regioni come segue:
1. Istogramma 1. Creare una regione rettilinea A in modo da includere tutti i leucociti CD45
piastrine, i residui di eritrociti e gli aggregati.
2. Istogramma 1. Creare una regione amorfa E nei linfociti (CD45 brillante, scatter laterale basso).
3. Istogramma 2. Creare una regione rettilinea B nell'istogramma 2 in modo da includere tutti gli eventi CD34
con scatter laterale da basso a intermedio. Impostare un conteggio di arresto di 75.000 eventi (eventi CD45
nell'istogramma 2.
4. Istogramma 3. Creare una regione amorfa C sull'istogramma 3 in modo da includere tutti gli eventi CD45
raggruppati.
5. Istogramma 4. Creare una regione amorfa D sull'istogramma 4 in modo da includere tutti gli eventi raggruppati
con scatter laterale intermedio e scatter frontale da intermedio a elevato.
6. Istogramma 5.
dell'espressione CD45 negli eventi CD34
7. Istogramma 5.
Flow-Count Fluorospheres, inclusi i dipoli.
dell'istogramma 5.
NOTA:
8. Istogramma 6. Copiare la regione D dall'istogramma 4 come regione F nell'istogramma 6.
9. Istogramma 7. Creare una regione rettilinea G sull'istogramma 7 in modo da includere solo tutti i singoletti
di Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres. Per calcolare automaticamente i numeri assoluti di HPC di
CD34 , è possibile etichettare la regione G come "CAL" (per maggiori dettagli, fare riferimento al manuale
+
dello strumento).
10.Istogramma 8. Creare una regione rettilinea J sull'istogramma 8 per separare i leucociti vitali (eventi negativi
7-AAD) dagli eventi non vitali (soprattutto Stem-Trol Control Cells positivo per colorazione 7-AAD).
Creazione delle Finestre di Analisi
Creare i gate come segue:
1. Istogramma 1. Assegnare "H" all'istogramma 1 per visualizzare tutti gli eventi ad eccezione di Stem-Count o
Flow-Count Fluorospheres. Fare riferimento al manuale dello strumento per la creazione di "not gates ".
2. Istogramma 2. Assegnare "A" all'istogramma 2 per visualizzare tutti gli eventi CD45
3. Istogramma 3. Assegnare "A" e "B" (AB) all'istogramma 3 per visualizzare tutti gli eventi CD45
4. Istogramma 4. Assegnare "A", "B" e "C" (ABC) all'istogramma 4 per visualizzare tutti gli eventi CD45
raggruppati con scatter laterale da basso a intermedio ed espressione di colorazione CD45 bassa. Gli eventi
della regione ABCD sono reali HPC di CD34
5. Istogramma 5. Senza gate per visualizzare tutti gli eventi.
6. Istogramma 6. Assegnare "E" per visualizzare i linfociti come controllo visivo sul discriminatore.
7. Istogramma 7. Assegnare "H" all'istogramma 7 per visualizzare Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres,
inclusi i dipoli.
8. Istogramma 8. Assegnare "A" all'istogramma 8 per visualizzare gli eventi CD45
Configurazione del citometro a flusso
1. Verificare che il citometro a flusso sia correttamente allineato e standardizzato per lo scatter di luce e l'intensità
della fluorescenza, secondo le linee guida del produttore e del laboratorio. Verificare che la compensazione
del colore sia impostata per il funzionamento standard. Per maggiori istruzioni, fare riferimento al manuale
dello strumento.
2. Agitare le provette test per 5 secondi.
3. Effettuare l'acquisizione dei dati nel citometro a flusso. È necessario analizzare almeno 75.000 eventi CD45
4. Regolare il discriminatore e le regioni analizzando la provetta TROL 45/34/7-AAD.
Esempio di Analisi
Gli istogrammi riportati nell'APPENDICE vengono visualizzati in ordine ascendente come indicato nel protocollo.
B60231–AE
Creare una regione Quadstat I sull'istogramma 5 per verificare il limite inferiore
Creare una regione amorfa H sull'istogramma 5 per circondare Stem-Count o
Accertarsi che la regione H sia disegnata come regione AMORPHOUS (Amorfa).
.
+
La regione H deve trovarsi nell'angolo in alto a destra
.
+
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ed eliminare le
+
.
+
CD34
+
+
.
+
+
)
+
dim
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+
CD34
+
.
+