Beckman Coulter IM3632 Manual De Instrucciones página 25

• Software di sistema stemCXP SOLO per analisi automatica di Stem-Trol Control Cells su citometri a flusso
FC 500 dotati di software CXP.
PROCEDURA
Se viene utilizzata l'analisi automatica, fare riferimento alla stemCXP System Guide (Guida al sistema stemCXP)
in dotazione al software di sistema stemCXP per istruzioni complete.
Per l'analisi manuale, fare riferimento alle istruzioni accluse alla confezione di Stem-Kit Reagents e alla procedura
seguente.
NOTA: Al fine di standardizzare l'analisi, nel momento in cui viene ricevuto un nuovo
Stem-Kit Reagents e successivamente a cadenza quotidiana, eseguire una verifica della
procedura mediante colorazione di Stem-Trol Control Cells con un campione di sangue
periferico normale di un donatore sano. Inoltre, dal momento che Stem-Trol Control Cells
è costituito da cellule stabilizzate (ovvero cellule non vitali), è possibile verificare
visivamente la colorazione del colorante di vitalità 7-AAD su Stem-Trol Control Cells
(consultare la sezione: Creazione degli istogrammi).
Verificare che il citometro a flusso sia correttamente allineato e standardizzato per l'intensità della fluorescenza,
secondo le linee guida del produttore e del laboratorio. Verificare che le impostazioni di compensazione della
fluorescenza siano regolate correttamente secondo le linee guida del produttore e del laboratorio.
Portare il reagente di controllo e gli anticorpi a temperatura ambiente.
Per ciascun esperimento, etichettare una provetta: TROL 45/34/7-AAD.
1. Pipettare nella provetta 20 µL di CD45-FITC/CD34-PE.
2. Pipettare nella provetta 20 µL di colorante di vitalità 7-AAD.
IMPORTANTE:
3. Nella parte inferiore della provetta, pipettare accuratamente 100 µL di campione di sangue intero normale
ben miscelato utilizzando una pipetta di ripetizione o spostamento positiva calibrata.
4. Preparare e aggiungere Stem-Trol:
• Agitare Stem-Trol Control Cells per 5 secondi.
• Pipettare accuratamente nella provetta 20 µL di Stem-Trol Control Cells.
• Agitare le provette per 5 secondi.
5. Incubare a temperatura ambiente (18–25 °C) per 20 minuti, al riparo dalla luce.
6. Aggiungere nella provetta 2 mL di 1X NH
secondi.
Per informazioni sulla preparazione della Lysing Solution, fare riferimento alle istruzioni accluse alla
confezione di Stem-Kit Reagents.
7. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, al riparo dalla luce.
8. Conservare le provette in un rack posizionato sul ghiaccio (2–8 °C), al riparo dalla luce.
IMPORTANTE:
9. Miscelare delicatamente Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres capovolgendo la fiala 3–5 volte prima
dell'uso. Per ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria, evitare l'eccessiva miscelazione.
10.Prima dell'acquisizione, pipettare nella provetta 100 µL di Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres.
11. Agitare per 5 secondi subito dopo ciascuna aggiunta. Conservare a una temperatura di 2–8 °C. Agitare di
nuovo subito prima dell'acquisizione in citometria a flusso.
B60231–AE
Se il campione di sangue resta nella parte superiore o laterale della provetta test,
potrebbe verificarsi il rischio di lisi incompleta. Fare attenzione durante la pipettatura
onde evitare che il sangue tocchi la parte superiore o laterale della provetta test. Per
rimuovere tutte le tracce del campione di sangue dalla parte superiore o laterale della
provetta test, se necessario, pulire la provetta con un tampone di cotone.
Rischio di ottenere risultati errati in caso di pipettatura di bolle d'aria. La miscelazione
eccessiva di Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres potrebbe comportare la
formazione di bolle d'aria. Evitare l'eccessiva miscelazione di Stem-Count o
Flow-Count Fluorospheres e non pipettare bolle d'aria nelle provette campione.
Cl Lysing Solution preparata e agitare immediatamente per 5
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