Beckman Coulter IM3632 Manual De Instrucciones página 41

10.Antes da aquisição, pipete 100 µL de Stem-Count Fluorospheres ou Flow-Count Fluorospheres para o tubo
de amostra.
11. Misture no vortex durante 5 segundos imediatamente após cada adição. Armazene a uma temperatura entre
2 e 8 °C. Repita o processo de mistura no vortex imediatamente antes da aquisição por citometria de fluxo.
IMPORTANTE:
Resumo da preparação (Rótulo do tubo de amostra: TROL45/34/7-AAD)
Reagentes e amostras
CD45-FITC / CD34-PE
Corante 7-AAD para verificação de
viabilidade
Sangue total
Stem-Trol Control Cells
Vortex — Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos. Proteger da luz
1X NH Cl Lysing Solution
4
Vortex — Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Proteger da luz
Stem-Count Fluorospheres
DELIMITAÇÃO MANUAL E MÉTODO DE ANÁLISE
Configuração do protocolo
O citómetro de fluxo deve estar equipado para detetar Forward Scatter (Dispersão frontal), Side Scatter (Dispersão
lateral) e quatro canais de fluorescência. Para o canal FL3 (para monotorização de Stem-Count Fluorospheres
ou Flow-Count Fluorospheres) utilize um filtro passa-banda de 620 nm. Para o canal FL4 (para monitorização do
marcador de viabilidade 7-AAD) utilize um filtro de passagem de onda longa de 675 nm.
NOTA: Para Stem-Trol Control Cells, deve seguir-se o mesmo esquema de delimitação e a
mesma série de 8 histogramas indicados para a análise de espécimes. Como as
Stem-Trol Control Cells possuem caraterísticas dimensionais semelhantes às das
células hematopoiéticas imaturas normais e expressam antigénios CD45 e CD34
em densidades que se aproximam das mesmas, não é necessário modificar os
limites de região para os canais Forward Scatter (Dispersão frontal), Fluorescence
1 (Fluorescência 1) e Fluorescence 2 (Fluorescência 2). No entanto, dado que as
caraterísticas de Side Scatter (Dispersão lateral) das Stem-Trol Control Cells são únicas,
pode ajustar os limites de região para Side Scatter (Dispersão lateral). As regiões A, B,
C e D (consulte o título «Criação de regiões» para obter a definição das regiões) devem
ser modificadas para incluir o aglomerado de caraterísticas de Stem-Trol Control Cells.
Criação dos Histogramas:
Crie histogramas da seguinte forma:
1. Crie o Histograma 1 como FL1 CD45-FITC vs. Side scatter (Dispersão lateral).
2. Crie o Histograma 2 como FL2 CD34-PE vs. Side scatter (Dispersão lateral).
3. Crie o Histograma 3 como FL1 CD45-FITC vs. Side scatter (Dispersão lateral).
4. Crie o Histograma 4 como Forward Scatter (Dispersão frontal) vs. Side Scatter (Dispersão lateral).
5. Crie o Histograma 5 como FL1 CD45-FITC vs. FL2 CD34-PE.
6. Crie o Histograma 6 como Forward Scatter (Dispersão frontal) vs. Side Scatter (Dispersão lateral).
7. Crie o Histograma 7 como Time (Tempo) vs. FL3 Stem-Count ou Flow-Count Fluorospheres.
8. Crie o Histograma 8 como FL4 7-AAD vs. Side scatter (Dispersão lateral).
Os Histogramas 1 a 4 destinam-se a caraterizar HPC CD34
de análise. Estes primeiros quatro histogramas estão configurados de acordo com as orientações da ISHAGE
B60231–AE
Risco de resultados errados se a amostra for analisada mais de 1 hora após adicionar
Stem-Count Fluorospheres ou Flow-Count Fluorospheres. As amostras preparadas
devem ser analisadas no espaço de 1 hora após adicionar Stem-Count Fluorospheres
ou Flow-Count Fluorospheres.
Volume
20 µL
20 µL
100 µL
20 µL
2 mL
100 µL
, um processo que pode ser adiado até à etapa
+
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