Beckman Coulter IM3632 Manual De Instrucciones página 48

Klargøringsoversigt (etikette på prøverør: TROL45/34/7-AAD)
Reagenser og prøver
CD45-FITC / CD34-PE
7-AAD levedygtighedsfarvestof
Fuldblod
Stem-Trol Control Cells
Vortex – Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter. Beskyt mod lys
1X NH Cl Lysing Solution
4
Vortex – Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter. Beskyt mod lys
Stem-Count Fluorospheres
MANUEL GATING OG ANALYSEMETODE
Indstilling af protokol
Flowcytometret skal være udstyret for at detektere Forward Scatter (forlæns spredning), Side Scatter
(sidelæns spredning) og fire fluorescenskanaler. kaFor FL3-kanalen (til fluorescensovervågning på Stem-Count
Fluorospheres eller Flow-Count Fluorospheres) skal der benyttes et pasfilter med en bånd på 620 nm. Til
FL4-kanalen (til overvågning af 7-AAD Viability Dye) skal der benyttes et pasfilter med en længde på 675 nm.
BEMÆRK: Til Stem-Trol Control Cells følges samme gatingskema og serier af 8 histogrammer
som for prøveanalyser. Fordi Stem-Trol Control Cells har størrelsesegenskaber, der
er tæt på og viser CD45- og CD34-antigener med tætheder tæt på normale umodne
hæmatopoietiske celler, er det ikke nødvendigt at ændre regionens grænser langs
kanalerne Forward Scatter (forlæns spredning), fluorescens 1- og fluorescens 2. Fordi
karakteristikaene for Stem-Trol Control Cells Side Scatter (sidelæns spredning) er
unikke, kan der imidlertid være behov for at justere regionens grænser langs Side Scatter
(sidelæns spredning). Region A, B, C og D (se afsnittet Oprettelse af region for definition
af region) skal ændres for at inkludere Stem-Trol Control Cells karakteristiske klynger.
Oprettelse af histogram
Opret histogrammer på følgende måde:
1. Opret histogram 1 som FL1 CD45-FITC vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
2. Opret histogram 2 som FL2 CD34-PE vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
3. Opret histogram 3 som FL1 CD45-FITC vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
4. Opret histogram 4 som Forward Scatter (forlæns spredning) vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
5. Opret histogram 5 som FL1 CD45-FITC vs. FL2 CD34-PE.
6. Opret histogram 6 som Forward Scatter (forlæns spredning) vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
7. Opret histogram 7 som tid vs. FL3 Stem-Count eller Flow-Count Fluorospheres.
8. Opret histogram 8 som FL4 7-AAD vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
Histogram 1 til 4 er beregnet til at karakterisere CD34
Disse første fire histogrammer er indstillet i henhold til ISHAGE-retningslinjerne for CD34
flowcytometri (2,3).
Histogram 5 og 7 er beregnet til at overvåge parametre, der er vigtige for det næste trin. Disse omfatter diskriminator
til Forward Scatter (forlæns spredning), antallet af CD45
af enkelte fluorofærer.
Histogram 8 er beregnet til at diskriminere og analysere brugbare hændelser fra ikke-brugbare hændelser, når det
er nødvendigt.
Oprettelse af region
Opret regioner på følgende måde:
1. Histogram 1 – Opret en retlinjet region A for at medtage alle CD45
røde blodceller og aggregater.
2. Histogram 1 – Opret en amorphous (amorf) region E på lymfocytterne (lys CD45, lav side scatter (sidelæns
spredning)).
B60231–AE
Volumen
20 µL
20 µL
100 µL
20 µL
2 mL
100 µL
HPC, en proces, der kan udskydes til analysetrinnet.
+
-hændelser, der skal indsamles, og korrekt akkumulering
+
-leukocytter, og fjern blodplader, debris fra
+
48 of 128
-cellefastlæggelse med
+